elisa (enzyme-linked immunosorbent assay)
ELISA (xét nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết với enzyme) là một kỹ thuật xét nghiệm dựa trên đĩa được thiết kế để phát hiện và định lượng peptide, protein, kháng thể và hormone. Trong ELISA, kháng nguyên phải được cố định trên bề mặt rắn và sau đó phức hợp với kháng thể liên kết với enzyme . Phát hiện được thực hiện bằng cách đánh giá hoạt động của enzyme liên hợp thông qua quá trình ủ với chất nền để tạo ra sản phẩm có thể đo được.
Yếu tố quan trọng nhất của chiến lược phát hiện là tương tác kháng thể-kháng nguyên có độ đặc hiệu cao. ELISA thường được thực hiện trong các đĩa polystyrene 96 giếng (hoặc 384 giếng), sẽ liên kết thụ động với kháng thể và protein. Chính sự liên kết và cố định thuốc thử này khiến ELISA dễ thiết kế và thực hiện. Việc cố định các chất phản ứng của ELISA trên bề mặt đĩa vi mô giúp dễ dàng tách vật liệu liên kết khỏi vật liệu không liên kết trong quá trình xét nghiệm. Khả năng rửa trôi các vật liệu liên kết không đặc hiệu này khiến ELISA trở thành một công cụ mạnh mẽ được sử dụng trong quá trình phát hiện kháng nguyên và kháng thể.
- Các dạng ELISA:
ELISA có thể được thực hiện với một số sửa đổi đối với quy trình cơ bản: trực tiếp, gián tiếp, Sandwich hoặc cạnh tranh. Bước quan trọng, cố định kháng nguyên quan tâm, có thể được thực hiện bằng cách hấp phụ trực tiếp vào đĩa thử nghiệm hoặc gián tiếp thông qua kháng thể bắt giữ đã được gắn vào đĩa. Sau đó, kháng nguyên được phát hiện trực tiếp (kháng thể chính được gắn nhãn bằng enzyme) hoặc gián tiếp (kháng thể thứ cấp được gắn nhãn bằng enzyme). Các kháng thể phát hiện thường được gắn nhãn bằng Ankaline phosphatase (AP) hoặc horseradish peroxidase (HRP). Có nhiều loại chất nền để thực hiện ELISA với liên hợp HRP hoặc AP. Việc lựa chọn chất nền phụ thuộc vào độ nhạy của xét nghiệm cần thiết và thiết bị có sẵn để phát hiện tín hiệu (máy quang phổ, máy đo huỳnh quang hoặc máy đo độ sáng).
1. ELISA trực tiếp:
Để phát hiện trực tiếp, kháng nguyên được phủ lên một đĩa nhiều giếng được phát hiện bằng kháng thể đã được liên hợp trực tiếp với một enzyme. Phương pháp phát hiện này là một lựa chọn tốt nếu không có bộ dụng cụ ELISA thương mại nào cho protein mục tiêu của bạn
2. ELISA gián tiếp:
Đối với phát hiện gián tiếp, kháng nguyên được phủ lên một tấm nhiều giếng được phát hiện trong hai giai đoạn hoặc hai lớp. Đầu tiên, một kháng thể chính không được đánh dấu, đặc hiệu cho kháng nguyên, được áp dụng. Tiếp theo, một kháng thể thứ cấp được đánh dấu bằng enzyme được liên kết với kháng thể đầu tiên. Kháng thể thứ cấp thường là kháng thể chống loài và thường là đa dòng.
3. ELISA Sandwich:
ELISA sandwich thường yêu cầu sử dụng các cặp kháng thể phù hợp, trong đó mỗi kháng thể đặc hiệu với một phần khác nhau, các epitopes của phân tử kháng nguyên. Một kháng thể đầu tiên (được gọi là kháng thể bắt giữ) được phủ vào các giếng. Sau đó, dung dịch mẫu được thêm vào giếng. Một kháng thể thứ hai (được gọi là kháng thể phát hiện) theo bước này để đo nồng độ của mẫu.
4. ELISA Competitive:
ELISA cạnh tranh (còn được gọi là ELISA ức chế) là quá trình phản ứng cạnh tranh giữa kháng nguyên mẫu và kháng nguyên liên kết với các giếng của một tấm vi mô với kháng thể sơ cấp. Đầu tiên, kháng thể sơ cấp được ủ với kháng nguyên mẫu và các phức hợp kháng thể-kháng nguyên thu được được thêm vào các giếng đã được phủ cùng một kháng nguyên. Sau thời gian ủ, bất kỳ kháng thể nào không liên kết đều được rửa sạch. Càng có nhiều kháng nguyên trong mẫu, thì càng có nhiều kháng thể sơ cấp liên kết với kháng nguyên mẫu. Do đó, sẽ có một lượng nhỏ kháng thể sơ cấp có sẵn để liên kết với kháng nguyên được phủ trên giếng, dẫn đến giảm tín hiệu huỳnh quang.
