REALTIME PCR

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một trong những công nghệ mạnh mẽ nhất trong sinh học phân tử. Sử dụng PCR, các trình tự cụ thể trong khuôn mẫu DNA hoặc cDNA có thể được sao chép hoặc “khuếch đại” lên hàng nghìn đến hàng triệu lần bằng cách sử dụng oligonucleotide đặc hiệu trình tự, DNA polymerase chịu nhiệt và chu kỳ nhiệt. Trong PCR truyền thống (điểm cuối), việc phát hiện và định lượng trình tự được khuếch đại được thực hiện vào cuối phản ứng sau chu kỳ PCR cuối cùng và bao gồm phân tích sau PCR như điện di gel và phân tích hình ảnh. Trong PCR định lượng thời gian thực, sản phẩm PCR được đo ở mỗi chu kỳ. Bằng cách theo dõi các phản ứng trong giai đoạn khuếch đại theo cấp số nhân của phản ứng, người dùng có thể xác định số lượng mục tiêu ban đầu với độ chính xác cao.

Trong Realtime PCR , lượng DNA được đo sau mỗi chu kỳ thông qua thuốc nhuộm huỳnh quang tạo ra tín hiệu huỳnh quang tăng dần theo tỷ lệ thuận với số lượng phân tử sản phẩm PCR (amplicon) được tạo ra. Dữ liệu thu thập được trong pha mũ của phản ứng tạo ra thông tin định lượng về lượng ban đầu của mục tiêu khuếch đại. Các chất báo cáo huỳnh quang được sử dụng trong Realtime PCR  bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA sợi đôi (dsDNA) hoặc các phân tử thuốc nhuộm gắn vào các đoạn primer PCR hoặc đầu dò lai với sản phẩm PCR trong quá trình khuếch đại. Sự thay đổi huỳnh quang trong suốt quá trình phản ứng được đo bằng một thiết bị kết hợp chu kỳ nhiệt với khả năng quét thuốc nhuộm huỳnh quang. Bằng cách vẽ đồ thị huỳnh quang so với số chu kỳ, thiết bị Realtime PCR  tạo ra một đồ thị khuếch đại biểu thị sự tích tụ của sản phẩm trong suốt thời gian của toàn bộ phản ứng PCR (Hình 1).

Ưu điểm của Realtime PCR bao gồm:
• Khả năng theo dõi tiến trình phản ứng PCR khi nó diễn ra theo thời gian thực
• Khả năng đo chính xác lượng amplicon ở mỗi chu kỳ, cho phép định lượng chính xác lượng vật liệu ban đầu trong mẫu
• Phạm vi phát hiện động tăng lên
• Quá trình khuếch đại và phát hiện diễn ra trong một ống duy nhất, loại bỏ các thao tác sau PCR